膜片钳实验技术之数据分析
(2014-01-16 14:07:39)
、a. 在C-fast，和C-slow补偿的时候应该从哪些指标进行观察（尤其是还未开始记录时），以判断补偿是否合适？
应该主要从封接测试中的测试电流波形来观察常吧?电容电流很大或者补偿过渡都会有异常的图形出现 。
b. 漏减程序中的setting
times（指第一个漏减脉冲施加前细胞处于Vsub的时间以及从最后一个漏减脉冲结束至步阶脉冲开始前细胞处于细胞钳位电压（Vh）的时间）在刘振伟的《膜片钳pCLAMP采样的P
/N漏减分析》一文中并未明确指出应设计多长时间，只是说需要将其对记录电流的影响减到最小。那么这一时间应该怎样设制比较好呢？
好像在刘振伟的另一篇文献中提到setting
times应该等于步阶脉冲时间．而Ｔ１即漏减脉冲之间的时间间隔应该大于步阶脉冲时间你在数据库中再搜索印证一下．慢电容电流补偿不好的话测试电流图形与基线不能很好的重合，过度补偿电容电流会出现反向的电流，即本来需要的电流是外向的却出现内向的，（电流有向下平移的倾向，个人总结），也有可能出现异常的钠电流，这一点在刘振伟的幻灯中曾经提到过。其他的文献很少，没有见到介绍settingtime的。正象在AXON的使用说明书上写的那样,不推荐在数据采集阶段对电流给与过多的补偿操作,否则可能会丢失一些有用的信息,误导最终的结果分析,或者整个的毁掉实验数据.在处理数据阶段,也有可以补偿漏电流的软件补偿,可以考虑使用.不过,我在记录数据是,还是主要应用COMMANDER上的漏电流补偿,在分析的时候具体分析在给予软件补偿..P/N补偿的确是不错的东西,不过操作不当,容易造成不好的影响,还是慎重考虑小心使用.
c.
下面图中记录到的有没有钾电流，是否受到电容电流的影响？应该如何排除电容电流的干扰？是否需要设置漏减程序，应怎样设置？如果对记录后的图像进行分析时应该怎样使用漏减。
图中虽然外向的电流很大但瞬时漏电流很明显，如果封接电阻很小的话，根据Ｉ＝Ｕ／Ｒ稳态漏电流也会很大．稳态漏电流可以通过ＣＬＡＭＰＦＩＴ中的漏减功能给予消除但不适合于电压门控性离子通道的漏电流消除．参见刘振伟文献．pclampfit
做出来的图形copy到画图另存为jpg将图片格式改为jpg。
2、刺激伪迹过大及防止。1）尽量减少刺激脉冲的波宽和强度。2）在动物体或标本上，尽量延长刺激部位
的距离，在刺激电极和引导电极之间加一接地电极，此电极离引导电极愈近，刺激伪迹就越小；采用变换刺激极性，结合叠加处理，可抵消伪迹。
3、问一个问题：大家有谁是在脑片上做EPSC的？我们的系统是用的ＨＥＫＡ，我知道axon有很多辅助的软件来统计用，但是HEKA上面很少，我现在为统计EPSC感觉很头疼，比如频率，幅度之类，一个个去手工检测太麻烦，请问大家有没有好一点的办法？
我在脑片上作过EPSC。我们用的是AXON200B，分析软件主要是clampfit，如果是做EPSC的话，分析幅值已足够，它可以将一群数据联成一个文件，只要你的刺激protocol是相同的，在选定的两个cursor之间，就可以计算出peak,slope等参数。据我所知，Igor也有相似的功能，它也可以将一桢桢的sweep进行群分析。我不知你为什么要分析频率，EPSC主要指的是诱发的电位，它和你的刺激伪迹是紧密联系的，所以并不存在频率的问题。
4、可能我没有说清楚，我记的是sEPSC，是突触前自发释放的event，所以分析频率是最重要的，IGOR好像比较麻烦，我现在在研究一个叫mini
analysis的软件，是专门分析EPSC频率和幅度的，功能ms很强但这个是收费的，我只能用到demo版，很多功能实现不了，大家可以帮忙看看。下载地址：www.synaptosoft.com，我们可以交流一下这个软件的使用，呵呵。
这个软件非常好用，（我们一直都在用它……）
虽然是DEMO版，但是基本功能都已经具备了，包括你所要分析的频率等。最重要的是，它可以直接进行频率分析并作图。目前我们开发的功能也不是很多，有很多DEMO版可以使用的功能我们都还没有用呢，作为DEMO版，其最大的限制是在存储方面，它不允许数据的更改和保存，而其他的一些功能，你可以通过数据导出到EXCEL中进行后期处理。不过，我的感觉是，分析mEPSC实在是很复杂的一项工作，因为数据采集的关系，很多数据都不得不手动分析，我常常要花比做试验更多的时间来分析。
5、你好,请教一个小问题:怎样可以用AXON(windows)来记录诱发电位, 线路的连接和软件的设置如何？
诱发电位，不知你指的是胞内记录还是场电位。不管怎样，这两者在线路连接上是基本相同的。线路的连接，你们应该有Digitizer
的吧，与自发电位不同的是，诱发电位要将刺激器或者刺激隔离器通过DIGIDATA的Anolog
output或者Digital和电脑连接起来，这样通过软件clampfit就可以给出刺激。如果需要复杂的刺激模式，你可以在刺激器上编程（具体要依据刺激器的说明书），再通过软件触发。软件的设置，场电位的话，打到I=0模式，whole-cell的话，可以选择I-clamp或者I=0，胞内记录我没做过，不知道。protocol编辑，和电流箝模式相配合，Inputs要改成单位是mV的，另外，Wave里要多加一个触发电平，加在刺激器的位置上。
6、我现在在分析时有几个问题：1.我是heca的系统，从pulse中把数据转换过来时，坐标轴的尺度就变掉了，很麻烦。2。不知道你们是怎么鉴别EPSC的，有些比较小的EPSC我很难跟干扰区别开来，你们是用什么标准来区别EPSC的？有些发放比较大，但其并不表现为快速上升缓慢下降，我不知道这些发放要不要计算在里面。3.用这个软件我觉得还是要一个一个event来重新鉴别，防止除错，这样工作量还是很大。。。你们是怎么做的？
1）、从来没有用过EPC系列的，数据转换我实在是不大懂；AXON的可以直接打开，但是我从来没有注意过坐标问题；
2）、分析mEPSC首要的一点就是确定阈值，换句话说，就是多大的波你才要，这个的选择要看你的实验结果了。一般我会选择比噪音水平高2倍左右的。但在同一次实验里，最好这些参数保持一致。
3）、这个手动分析是不可避免的，因为这个软件会把所有符合你的参数设置的波形都揪出来，而且有可能重复计数。所以我每次都会花更多的时间来分析数据。
4）、为了更好的学习这个软件，你可以到该公司的网站上下一个说明书，它会告诉你这个软件能做什么事。
7、那么对于有些点,peak值很大,但其decay相很快,就是说不满足快速上升和缓慢下降的形状,这种点怎么取舍?
首先，你有没有阻断动作电位的发放，换句话说，这个peak是否动作电位？这一点可以通过peak的时相进行初步判断。
其次，你有没有通过外加阻断剂的方式进行排查。如果你加了阻断剂后这种波形还存在，那可能是其他的递质发放，或者干脆就是干扰，不必计入你所要分析的波形的考虑范畴。
第三，一般说来，我在分析mEPSC时，对于不太确定的波形，采取的是跳过的处理方式。
8、为什么我们记得全细胞钠电流，其I-V曲线关系总是不对。经常是在-70或-80mv开始出现钠电流，但是是最大钠电流，以后随着电压增加电流减少。已经补偿过膜电容和串联电阻，还有什么原因？
首先要搞清楚你记录到的是不是钠电流，那么就用钠通道阻断剂阻断一下看看电流是否变化。有时候你记录到的可能是漏电流而不是钠电流。钠电流不应该是线性的，而是刚开始比较小，然后增大，之后再减小，呈"U"形，与钙离子通道相似。
出现你这种情况有如下几种可能：1）封接的电阻不够大，或者破膜后封接变的不严了。一般来说封接至少要达到4G以上才可以。如果封接的不严，不管你怎么补偿也难以记录出正常的电流。2）钳制电压有问题，也许你是按照文献上设置的，但很多对膜片钳软件不太熟悉的人容易弄错。你可以在软件中把你自己设计的protocol
图形预览一下，看钳制电位设置是否正确，如果不正确会导致钠通道失活，将无法记录出电流。以前我就见过一个人把这个给设置错了。改正后就记录出来了。
9、你有正版mini分析软件吗？
我们用的分析软件是Clamfit,axon公司的正版的软件，很好用。
把原理搞清楚对于正确设置参数很有好处，对于结果的理解以及写文章时的用词也很有好处。首先你要有一点电学知识，也不用太难的，就能把欧姆定律真正理解清楚就可以了，然后需要一点数学知识，理解二次函数。其它的也就没有什么，然后找一本比较好的膜片钳的书，好好读，就能明白。
做新分离的大鼠血管平滑肌细胞全细胞钙离子通道或钾离子通道难度确实很大，并且一开始的频繁失败很容易让人泄气，以为这是不可能做成的，甚至怀疑别人是否真的能做出来。但要有信心，确实是能做出来的。我从最初的无法分离出单个细胞，到最后成功记录出全细胞钙、钾电流确实遇到了很大困难，但最终在高人的帮助下，以及自己的刻苦努力下，终于做了出来。
关于破膜问题，用负压吸引还是能破开的，并且记录的也很稳定，但成功率很低。根据我的情况，分离细胞成功率大约70%，封接成功（电阻达到2G左右）率大约20%，封接成功后破膜成功（指破膜后封接稳定）率大约30%，破膜成功后能成功记录出电流的细胞大约30%。这样算下来成功率为0.7x0.2x0.3x0.3=0.014,就是说平均成功率1.4%。具体说就是一天也就能做出2-3个，就算很星云的了。用二性霉素穿孔，我没有尝试，但据说更难成功。
还是坚持负压吸引吧。
10、whole－cell recording的液接电位的补偿问题
我们一般都是在电极入水后补偿液接电位。但在下电极的过程中有时基线还在波动，有时还很大。按理说当形成giga－cell后，就不能在调节pipe－offset了。但是，当形成巨阻封接后，电极内液和浴液之间的接触就隔断了，然后吸破形成whole
cell。这个时候液接电位就消失了。但你入水时已经补了这个液接电位。也就是说形成whole
cell后多补了液接电位大小的电压。你记录的电位是实际电位加上液接电位的值。很多人电极内液都是用的葡萄糖酸钾，用axon的液接电位计算公式算的葡萄糖酸钾版的电极内液和外液的液接电位都是10mv以上。这个时候误差就大了。这就产生个问题：这个液接电位怎么补？什么时候补？不补的话你钳制电压应该钳多少，电流钳下记录的膜电位与实际膜电位差多少？请大家说说各自的液接电位补偿的做法和理由。
我本来是测钠电流的，没想到出现上面的结果，好像怎么看都不象一个正常的内电流。问题在哪里？
1 ）细胞外液为钾，钠，钙，镁，内液有氟化铯和氯化铯，请问液需要避光保存吗？
2
）因为配液浓度都不大，所以即使用电子天平，测量也比较困难，几十毫克的东西，难免有误差，请问内外液的离子浓度一定要非常精确吗？
3 ）内外液的PH值要精确到什么程度？ 因为文献有的说要7.4，有的又是7.3，影响应该不是很大吧?
根据我的观察，你的钳制电位好象是0mV,因为钠通道在0mV会失活，所以根本记录不出来正常的钠电流，你记录到的很可能是钙电流或者是残存的钠电流。请你重新检查一下你设置的protocol。我以前就帮别人解决过类似问题。产生这种情况的主要原因还是你没有把膜片钳原理弄清楚。
如果我没有看错，应该是你把保持电位（holding
potential）弄错了，本来应该是-80mV,而你设置的好象是0mV,钠通道在0mV大部分是失活的，所以你不可能记录出来电流。重新设置。
试剂浓度当然要精确，你可以一次多配一些就是了，比如配1000ml，把用量特别小的可以先溶解成100倍浓度，使用时候加溶液就可以了。
PH一般对电流影响不是太大，至少7.3与7.4相差不大。
内外液的离子浓度一定要比较精确才行哈，膜片钳的原理就是测试细胞破膜后，在一定条件下产生的细胞电流。可想而知，电流的动力的来自于细胞膜内外的电化学梯度，所以你的内外液的离子浓度不精确的话，结果一定不对。起码不准确。
关于PH，应遵循凝酸勿碱的原则。因为细胞外液偏碱的话，细胞的活性会有影响，偏酸的话则对细胞的影响不大。所以没有精确的PH计的话往往宁愿配的液体PH不到7.4
。我一般只调到7。2最多。但是写文章的话还是当然要写7.4的。
11、激活曲线公式：gCa/gCamax={1+exp[-(vm-vα1/2)/kα]}-1
失活曲线公式：ICa/ICamax={1+exp[(v-vi1/2)/ki]}-1
这是L型钙通道电流的公式，详见附件。请问上面各项（gCa；gCamax；vm ；vα1/2；
kα；ICa；ICamax；v；vi1/2；ki）的含义及怎样求上述各项
G为电导，G=I/(V-Vrev），Gmax 为最大电导。
Vm为测定激活曲线，通常用IV曲线的刺激电位。
Ica为记录得到的失活电流，ICamax为其最大值。
vα1/2、 kα、vi1/2、ki为该公式的拟合参数，可以用sigmaplot进行曲线拟合后得出。
12、我想用膜片钳做心肌细胞钙离子通道电流的测量，我做的是全细胞模式的，不过做了4个月了还是没有测到过钙通道电流。不知道是什么原因。
我们用的细胞是新生SD大鼠的心肌细胞。电极是国产的，没有抛光。细胞内外液成分是按照文献上写的配的，不过没有调节PH值（不知道这个影响大不大）。放大器是EPC10，我们破膜也是用负压吸破的，没有用ZAP。我现在还没有开始用灌流系统。
测电流时没有出现钙电流曲线，而且电流值会随着电压的增大而增大的。
你的问题很多，首先在做全细胞记录的时候电极可以不抛光，但抛光的话你会发现封接的好一点！现在有几个问题我想搞明白的：1，现在你究竟做到了那一步？是不能封接，不能破膜，还是不能记录出来电流？其实即使你封接阻抗也不会很高的，因为你的细胞没有处理好！培养的心肌细胞膜上会有很多的杂质，不驱除的话封接不会很好。所以我建议你加上灌流系统进行灌流。2，你设置的Protocol是什么？Holding
Potential
设置了多长时间？有没有达到钙通道足够的复活时间？3，电流值随电压的增大而增大，这样的电流值不是通道电流，你一定明白，通道电流有一定的I-V关系，记录的可能是电容电流和漏电流！4，我想提醒的是，pH值至关重要。记录钙电流的时候它关系到钙离子的络合状态进而调节钙离子的浓度和Rundown，所以应该好好分析一下原因！我相信一定可以做出来的！
13、我看的有关于用膜片钳检测离子通道的文献基本上都是阻滞被检测通道以外的通道，然后认为测得的电流就是该离子通道的电流了。好像没有讨论不同的离子通道之间的关系的，比如钠、钾离子通道的开、闭对钙通道的影响等，这是什么原因呢？我觉得不同的离子通道之间应该不是完全独立的啊
其实这个问题也不难理解，因为两个通道的电流叠加在一起的话就很难分析了，并且验证一个通道电流有很多的方法的，比如钠电流，首先它有自己独特的脉冲激活条件，再次要用TTX来验证这个电流！不过我认为你这个Idea特别特别的好，多数研究注重一个通道电流的特性，而忽视了不同通道的关系。我认为出现这个问题有几个原因：1），多数研究是电压门控的通道，这一类通道主要依靠闸门电流来激活通道电流，互相之间的关系可能不是很大，2），同时记录两个或两个以上电流脉冲很难控制，记录的电流可能互相影响，就没有办法分析了，比如激活，失活曲线！3），有的电流是没有办法同时记录的，钠电流和钙电流同时记录就不能分清楚彼此了，但钾电流可以和钠电流一起记录，4），在电压门控模式下谁能说的清楚是电压的影响还是通道电流彼此的影响？
我认为这个Idea有以下几个方面值得研究：1），一个通道变化引起离子浓度变化对另一个通道的影响，如心肌细胞膜上的钙通道开放引起胞内钙离子浓度的变化进而激活肌浆网上的钙通道引起钙释放，2），一个通道变化引起自身通道的变化，比如延迟整流钾电流的产生据推测是镁离子的屏障作用，谁能保证钾离子浓度的变化不对自身产生整流作用，3），一个通道变化引起的电位变化对另一个通道的影响，最典型的例子是钾通道的变化引起静息电位（或最大舒张电位）的变化对钠电流的影响了！4），配体门控通道之间的互相影响，这个中间很复杂，需要理顺。可以肯定的是钙离子作为第二信使对各个通道之间一定存在调节，不过这种调节在心肌细胞上不是很多。
14、V0.5和K是如何求得的，用origin 软件嘛？如何拟合Boltzmann 方程？
膜片钳软件里面都有这个功能。比如clampfit软件就能拟合。最好请教身边做过的人，否则很难处理成功。用origin
软件很好做得。首先做出散点曲线，如激活曲线，失活曲线，然后用S型曲线去fit。会给出如下结果：
Data: Data4_B
Model: Boltzmann
Chi^2/DoF = 0.00025
R^2 = 0.99918
A1 1.00676 \(177)0.0076
A2 0.03278 \(177)0.00759
x0 -85.14026 \(177)0.31465
dx 4.61757 \(177)0.24917
Xo=V1/2
Dx=k
15、激活与失活曲线拟和原理相同，公式相同，不过失活曲线
相对步骤少了一点，因为失活曲线拟和用的就是电流，不需要计算，而激活曲线的G要通过计算得出来。
具体G的计算公式是G=电流/（钳制电位-反转电位），所以在钳制电位为0的时候分母并不是0，而如果钳制电位刚好是反转电位的时候，由反转电位的定义可知道这个时候电流为0，0/0结果可以是任意数字。其实真正计算的时候你根本不用考虑这个问题。一般到了反转电位的地方都到了激活曲线的100%的地方了，可以参考前后两个点确定。
关于拟和曲线参数的意义，字母V当然是钳制电位了，这是已知数，Vh，是半数激活电位，就是在这个电位下，整个细胞中有一半的要分析的离子通道处于开放状态，k，斜率，表示离子通道开放比率随着电压变化的速率，越大，表示递增越快。
如果说具体步骤，简要说明如下：激活曲线
1）.先得到一个细胞的全细胞I-V曲线
2）.I-V曲线U形顶点右侧应该为直线，该直线与x轴的交点就是反转电位（电流为0时的电压）
3）.计算各刺激电位下的G，公式G=电流/（钳制电位-反转电位），有几个刺激电位，就得出几个电导数值，例如
V -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40
G 0.2 0.5 0.9 1.8 2.9 3.5 3.5 3.5
r 0.06 0.15 .... 1 1 1
不用我说最大电导就是3.5，一般来说最后几个刺激电位处电导应该都接近Gmax。
4）.计算个刺激电位下通道激活比率，
5）.然后把电压和r两列考到clampfit等软件中，用公式Bolzman方程拟和，拟和的过程中需要设置几个起始参数，你可以自己摸索，直到能顺利得出S形曲线，然后到参数一栏中，就能看到我们想要的Vh和k了，保存好这两个数值和拟和后的理想数值（就是各电压下拟和出来的曲线的r），然后拟和下一个细胞。
失活曲线拟和方法就是节省了步骤1，2，其它基本相同
一般来说任何通道都可以做激活曲线拟和，但要做失活曲线拟和，该通道电流必须是具有失活特性的，一般阳离子通道均具有这个特性，如钙离子通道。
16、向各位前辈请教关于激活与失活的问题：V0.5和K是如何求得的，用origin 软件嘛？如何拟合Boltzmann
方程？？
这是曲线拟和的问题，可用的软件很多，象Prism或Sigmaplot都可以作，Clampfit也可以作，但由于它的说明书没有详细怎么介绍，摸索起来麻烦一些。用Prism或Sigmaplot比较容易。以sigmaplot8.0为例，打开软件，把你测得的数据输进去，一栏输电压值作X，一栏输电流（或电导）值作Y，点击Stastistics
→ Regression Wizard，在Equation category中选择Sigmoidal，在Equation
Name中选择Sigmoida，3 Parameter。然后点击下一步，按要求把X，Y值配对应的数据栏，就行。
16、请问使用EPC9、EPC10的朋友
如果我要了解形成全细胞模式后细胞的静息电位，是不是在电流钳模式下将电流调为0后切换或电压钳，界面V-MENBRANE上显示的就是静息电位？！我分离的是心肌细胞，怎么用这种方式测出来才-15mv啊，我想我配的电极内液没有问题。
我用的是AXON，但仪器的原理是一样的。电流钳模式记录的就是电压值，测静息电位是在电流钳模式下。应该是在形成全细胞后，迅速倒至电流钳模式，钳制电流为0，电脑输出的就是静息电位值。至于你再倒至电压钳模式下，界面V-MENBRANE上显示的应该是你设置的钳制电压值，只不过由于serial
resistance以及液接电位的缘故，会和你设置的钳制电压值略有些差异。
17、在膜电容的计算公式Cm=τ
cⅠ0/ΔVm(1-Ⅰ∞Ⅰ0)中，我们的膜电容电流已经测出，但是如何通过膜电容计算公式用clampfit进行拟合分析并得到膜电容时间常数和稳定膜电容电流值，从而计算出膜电容值。我们采用的是Axopatch200B和Version6.0版膜片钳！
你把软件升级到8.0版，里面有一个Membrane Test，可以直接告诉你膜电容。
18、我在电极内液和细胞外液都用了TEA-Cl，仍然没有记到Ca电流，是什么原因？
说明:
1）.封接电阻>2G 欧
2）.破膜电阻400-800M欧
3）.钳制电位-50mV,1 run, 64 sweep, -40-0mV去极化刺激间隔30s
4）.电极内液中含20mmol的TEA-Cl,细胞外液中没有
5）.电极内液用KOH调PH到7.4
6）.细胞外液用含钙台氏液
那么你记录到什么电流呢？有钾电流吗？TEA只是抑制掉你引出电流中的钾电流成分，使你引出的钙电流突出一些。如果你的细胞本身什么电流也没有，加不加TEA，都是一个结果。
我曾经用大鼠引Ito，由于钙电流抑制不完全，在电流图像起始先看到一些向下的内向钙电流，然后被向上的外向钾电流掩盖。说明细胞好，封接好，这些电流都应该出来，重叠在一起。加抑制剂只是把这些电流分开来。
所以，首先你要确定你的细胞比较好，封接也好，可以引出电流，不论什么电流。如果这一步都达不到的话，你还是检查检查细胞的问题，封接有没有问题，钳制方案设置有没有问题。
如果只是钙电流出不来，能引出钾电流，那有可能封接还不太好。相对来说，钾电流封接电阻在细胞破膜后有100多M欧，就能引出来了。而钙电流必须要破膜后将近200M欧，才能看到钙电流。
另外还有一个可能是你加入TEA浓度比较高，改变细胞渗透压环境或pH，使细胞状态差。
根据我个人经验,您记录的应该什么电流都不是,而是细胞没有封接好的漏电流.一般细胞如果封接的很好,破膜后,如果钳制在-80mV附近,通道都没有开放,电阻应该很大,至少要2G左右的.你的只有400M欧姆,显然太小,所以漏电流很大。
漏电流的特点是IV曲线基本是一条直线,粗看起来各原始曲线之间间隔基本相等,就如同你提供的一样的.并且如果此时采用P/N
漏减技术的话,电流基本都会消失,就是各原始曲线都回到基线,而对应的IV曲线基本重合于水平轴.
我不知道你们破膜后-80电位下的电阻都有多大,如果很小的话,比如100M,那么当我们增加10mV的刺激电压时,单纯漏电流就是10mV/100M=0.1nA=100pA,这个电流可不是很小的,因为平滑肌细胞的钾离子通道电流最大也不过1000pA,如果是这样,你的漏电流就远大于你要的电流了,怎么可能得到可靠的通道电流呢.
一般封接后电阻最好能大于3G欧姆,破膜后也要在1G以上(-80mV钳制情况下).如果是钳制在0mV情况下那就另当别论了
P/N漏减，P就是刺激电位的意思， pulse，就是指你每一次给的刺激电位，比如依次从-60mV到+60mV，Step
为10mV,那么这些电位都是刺激电位，
N是个自然数，一般取2-8，常用的是4，当然要根据通道的特点选择。
P/N漏减的意思就是在正常的刺激电位前（或后）给予N个1/N大小的刺激电压（预刺激），比如N=4时，在给+40mV
刺激电位之前先给4次10mV的刺激电位，然后将这4次得到的电流加在一起，然后再从该正常刺激电位（+40mV）得到的电流中减去前面4次预刺激电流之和。
原理是：如果电位为漏电流，它应该是线性的，就是I-V曲线应该是一条直线，如果是通道产生的电流，它应该是非线性的。
这样在P/N的较小电位刺激下，一般不激活通道，只能得到线性部分，再将N次叠加，就得出该刺激电位对应的线性部分电流（漏电流），从总电流中减去漏电流就得到通道电流了。
补充：线性函数的特点是f=n*f(x/n),比如y=8x这个函数。而其它函数就不符合该特点。
说的可能不是很清楚。通电产生气泡是因为没有绝缘嘛
19、最近很郁闷，分离出的细胞老是很糟糕，破膜后所记录到的电流老是忽大忽小，作出的I-V曲线就老是会左移右移，是不是这样记录出来的电流就没有什么意义了啊？
问题出在什么地方呢？
是不是和你灌流有关系，你试一下记录电流的时候关掉灌流。
可能是，破摸后膜片有重新堵住RUPTURE的口。故电流忽大（开放）/忽小（堵住）。建议使用阻抗更小的电极。（这个问题我也遇到过，不过用小阻抗电极后，就OK
了。
20、稳态失活曲线应用双脉冲刺激参数获得。保持电压-80mV，条件脉冲从-90mV，每隔10mV连续去极化至0mV，持续时间1s，然后再给一去极化至0mV，持续时间200ms的测试脉冲。
请问：为什么平时做膜片钳实验的钳制电位一般都是-40mV的，而在文献中做失活曲线的实验中保持的钳制电位要-80mV或-90mV？
为什么要然后再给一去极化至0mV，持续时间200ms的测试脉冲？在制作失活曲线时有何作用？
我估计你看的肯定不是一篇文献,我看到的就有失活曲线-40 holding的啊.
由于L- CA通道会受很多其他通道的影响,所以-40
holding是为了消除NA通道,这个电位下大部分都失活了,但是如果你的细胞内外液里都没有NA
或者加了足量的TTX的话,就没有这个必要了,完全可以用-90holding的,这个时候就可以测T- CA了.
稳态失活的原理是测量该通道在经历了不同电位的除极后对后一次除极的影响,也就是两次除极之间的影响,所以当然有第二次0
mv的过程了,再着你可以仔细看看它的电极内外液里肯定没有NA的存在,并且还有TTX.
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